Primarycell division of Cosmo Bio Co Ltd. コスモ・バイオ株式会社 札幌事業部
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機能評価事業:食品成分などの機能性評価。細胞動画撮影

腸内環境改善研究受託サービス

腸内フローラ解析と腸管バリア機能解析により腸内環境研究をサポートします!

ヒト腸内には、ヒト一人分の細胞数(37兆個)の約30倍以上にあたる1,000兆個の色々な細菌が生存し、腸内フローラ(腸内細菌叢, Microbiome, intestinal flora)を構成しています。腸内細菌は菌種によってヒトの健康に有益な物質を産生する一方、有害な物質も産生しています。。近年、腸内細菌叢と疾患の関係についての研究が急速に進展し、潰瘍性大腸炎、クローン病などの消化器疾患をはじめ、肥満、糖尿病などのメタボリックシンドローム、アトピー、アレルギー、がんなどの免疫疾患、さらには自閉症やうつ病など精神疾患にいたるまで様々な論文報告が出てきました。

腸内フローラの変動は、遺伝的な要因よりも、生活習慣、特に食事に大きく左右されていることが示され、肥満状態と正常体重で腸内フローラが、Firmicutes / Bacteroidetes(門)において異なること、また腸内フローラが変化することで生活習慣病を引き起こす可能性も報告されています。1)2)3)4) これまで腸内フローラ改善法としてプレバイオティクス、プロバイオティクスの概念のもとオリゴ糖、乳酸菌、ビフィズス菌などの摂取が推奨されてまいりました。しかし近年の研究報告から、生体は腸管上皮杯細胞から分泌されるムチン、粘膜固有層の形質細胞(プラズマ細胞)より分泌されるIgAなどの物質を介して、腸内フローラとある一定の距離を置いて接しており、またこれらの物質は、摂取した食品成分によって大きく変動することが示されてきています。5)6)

これまで腸内細菌の解析には培養法が多く用いられてきました。しかしながら、培養法が確立できている菌種は腸内細菌のわずか20%程度で、解析には多大な労力と熟練が必要でした。近年はそれに代わって分子生物学的な手法が発達し、簡便に、再現性の高い解析が可能になりました。7)8) その中で、当社では腸内細菌の16S rRNA遺伝子による「リアルタイムPCR法」と「メタゲノム解析」を用いて解析いたします。解析オプションとしてメタゲノム解析データ成型解析によるα多様性、β多様性解析、Unifrac Distance解析をサービスメニューとして用意しております。さらに、当社では糞便中の腸内環境解析オプションとして、腸管バリア機能の指標といえるムチンとIgA含量の測定を行っています。

参考文献
  1. Ley RE, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2005 102: 11070-11075.
  2. Ley RE, et al., Nature 2006 444: 1022-1023.
  3. Vijay-Kumar M, et al., Science 2010 Mar 4. [Epub ahead of print]
  4. Ridaura VK, et al., Science. 2013 Sep 6; 341(6150): 1241214.
  5. Utama Z, et al., Plant Foods Hum Nutr. 2013 Jun; 68 (2): 177-83.
  6. 森田ら(2010)大豆たん白質研究 Vol. 13
  7. 松木(2007)日本細菌学雑誌 62: 255-261.
  8. 中山ら(2004)腸内細菌学雑誌 18: 147-153.
受託サービスフロー
糞便からのゲノムDNA抽出から菌叢解析
糞便からゲノムDNAを抽出し、16S rRNA領域配列を用いたReal Time PCR法、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析に て腸内フローラの解析を行います。Real Time PCR法では全菌種プライマーを用いて増幅された値を100%とした際に、Firmicutes及びBacteroidetesの2門がコントロール群と比較してどの程度変動があったかを調べる相対定量法 (ΔΔCq法) にて解析を行います。メタゲノム解析では次世代シーケンサーを用いて1検体あたり100,000リードを目標として腸内フローラの網羅的な解析を行います。
アレルギー発症モデルマウス6匹の糞便を用いた解析例
アレルギー発症モデルマウス6匹の糞便を用いた解析例
左:Normal群(通常食)
右:Test群(アレルギー誘導食)

β多様性解析(次世代シーケンス解析オプション)
メタゲノム解析データを成型し、PCoA解析2D、3Dプロットデータ、樹形図を作成致します。プロットデータでは距離が離れているほど、樹形図では上流で分かれているほど菌叢の差が大きい事を表します。
PCoA解析2D - β多様性解析(次世代シーケンス解析オプション)
3Dプロットデータ - β多様性解析(次世代シーケンス解析オプション)
樹形図作成 - β多様性解析(次世代シーケンス解析オプション)
樹形図作成

Unifrac distance 解析
サンプル間の総当たりの距離データ、検定結果を収録していますので、ご自身で任意の群間で距離の有意差検定も可能です。
Unifrac distance 解析

粉末糞便を用いた腸管バリア機能(IgA、ムチンの定量)
消化管内ではムチンとIgA等によって、腸内細菌や腸内細菌が産生する毒素が生体内に侵入してくることを阻止しています。 当社では腸管バリア機能として、糞便中のムチン含量およびIgA含量を測定します。
腸管の断面
IgAはELISA、ムチンは自社開発した蛍光測定キット(品番:FFA-MU-K01)にて測定致します。
糞便中の IgA 濃度
糞便中の IgA 濃度
糞便中のムチン濃度
糞便中のムチン濃度

αディフェンシン測定
マウスの小腸で分泌されるαディフェンシンのなかで最も抗菌活性が高く、腸内環境に与える影響が大きいと考えられている Cryptdin-4 (Crp4) 1) を ELISA により測定します 。2)なお、測定対象となるマウスストレインは ICR/CD1 です。3)    
参考文献
 1. Garcia AE, et al., Biochemistry. 2011 Dec 6;50(48):10508-19.
 2. Nakamura K, et al., Anal Biochem. 2013 Dec 15;443(2):124-31.
 3. Michael T. S. et al., Infect Immun. 2011 Jan; 79(1): 459–473.
参考価格
受託項目 標準価格(税抜)
基本料金
(1 試験当たり)
DNA溶液受取 ¥20,000
糞便受取 ¥50,000
gDNA抽出料金
(1 検体当たり)
1~11 検体 ¥15,000
12~23 検体 ¥12,000
24~47 検体 ¥10,000
48~95 検体 ¥8,000
96 検体以上 ¥7,000
リアルタイムPCR
(1 検体当たり)
1 反応(N=1) ¥9,000
2 反応(N=2) ¥18,000
次世代シーケンスによるメタゲノム解析
(1 検体当たり)
¥17,000~68,000
※検体数により単価設定が異なります。
お問合せください。
α、β多様性解析、樹形図作成 ご照会
ムチン測定
IgA測定(ELISA)
αディフェンシン測定(ELISA)*1
*1 マウス(CD1/ICR)のみ
  • Real Time PCR法は定量可能な菌種が限定されますが、簡便かつ迅速に結果を得ることができます。
  • 次世代シーケンスメタゲノム解析は一度に数百万~数億データ/Runの網羅的解析が可能で、シーケンスにより正確に菌を同定でき、未知の菌であっても検出が可能です。
提出するサンプルの調製法
サンプルの種類
盲腸内容物か糞便であることが多いですが、他の腸管内容物でもかまいません。もしくは、上記の検体から抽出した微生物ゲノムDNAからの解析もお請けします。 動物種は問いませんが、 ヒト糞便のお預かりに際しましては感染性のない検体であることが必須になりますので、非感染性検体の確認書に必要事項をご記入頂きます。

サンプルの必要最低量
腸管内容物、糞便の場合200 mg以上。ゲノムDNAの場合30 μL(抽出条件を添付してください。開示不可能の場合、解析時の希釈倍率をご指定下さい。)上記以下の場合、良好なシグナルが得られない場合があります。ムチン、IgA解析も同時にご依頼をいただく場合は合計で500 mg以上の糞便が必要です。

サンプルの推奨採取法及び送付方法
腸管内容物を解析検体とする場合は、摘出後組織を取り除いて速やかに凍結保存し、-20℃以下でご送付下さい。 マウス/ラットの糞便は、採取日の24時間分をすべて集めて下さい。コニカルチューブ等に集め、−20℃以下で保存、ご送付下さい。冷蔵では細菌叢が変化してしまいますのでご注意下さい。 ゲノムDNAの場合は4℃、または−20℃でご送付下さい。
ヒト採便に関しましてはテクノスルガ・ラボ社製の採便キットをご使用頂きます。ブラシタイプ、スプーンタイプの2種類ございます。
●ブラシタイプ 常温で1ヶ月迄、菌叢を動かさない事が可能であるため、常温で保管、ご送付頂くことが可能です。冷凍を行いますと内容物の保存液が膨張を起こし、採便キット破損の原因になります。ただし、夏の猛暑時などは、加温による膨張(液漏れ)を防ぐため、冷蔵便を推奨しています。主にご自宅で採便をされる場合に向いているキットになります。 なお、本タイプは保存液に糞便を懸濁するために秤量が出来ませんので、IgA や ムチンの定量をご希望の際にはご使用ただけません。
●スプーンタイプ 保存液が入っておりませんので冷凍にて保存、郵送をして頂きます。比較的安価な上に定量試験を行う場合、便の秤量が必要になりますので本タイプをご選択頂きます。主に病院等で採便される様な冷凍施設が充実している施設内での採便向きのキットになります。

試験後の検体の扱いについて

腸管内容物、糞便は破棄します。抽出DNAは納品いたします。糞便の返送が必要な場合はあらかじめご連絡をお願いいたしま す。なお、検体の保管業務は請け負っておりません。

サンプルご送付先
〒063-0061 北海道札幌市西区西町北12-1-12 YSビル TEL : 011-667-5911
コスモ・バイオ株式会社 札幌事業部宛
お見積り・ご注文方法
下記のリンクから見積のご依頼をお願い致します。
見積依頼フォーム
FAQ
【01】 サンプル種について
盲腸内容物か糞便であることが多いですが、他の腸管内容物でもかまいません。もしくは、上記の検体から抽出した微生物ゲノムDNAからの解析もお請けします。 動物種は問いませんが、ヒト糞便につきましては取り扱い制限が多いため、あらかじめ打ち合わせさせていただきます。
【02】 サンプルの採取方法について
マウス/ラットの糞便は、採取日の24時間分をすべて集めることを推奨しています。コニカルチューブ等に集め、-20℃以下で保存してください。
【03】 サンプルの最低必要量について
腸管内容物、糞便の場合 200mg
ゲノムDNAの場合 30ul(抽出条件を添付してください。開示不可能の場合、解析時の希釈倍率をご指定ください。) 上記以外の場合、良好なシグナルが得られない場合があります。
【04】 輸送時の保存温度について
マウス/ラットの腸管内容物、糞便の場合 -20℃
ゲノムDNAの場合 4℃
ヒト糞便については別途ご相談
【05】 料金形態について
サンプル数、検体によって単価が変わります。御見積は下記のフォームからご依頼ください。
見積依頼フォーム
単価例
糞便からゲノムDNAの抽出 7,000~15,000円/Sample
リアルタイムPCR 3,000円/反応
【06】 納期について
検体受領後約3~4週間です。
【07】 試験後の検体の扱いについて
糞便は破棄します。抽出DNAは納品致します。
糞便の返送が必要な場合はあらかじめご連絡をお願い致します。
なお、検体の保管業務は請け負っておりません。
【08】高脂肪食を4週間摂食後の結果が掲載されていますが、これより短い期間では有意差は出ないのですか?
被験物質によっては、1日~数日で変化が得られるものがあります。
パンフレットの取得データは、高脂肪食摂取によって観察される体重増加、脂肪組織肥大、血中脂質上昇といった生理的データに対して、効果のあった被験物質について合わせて腸内細菌叢解析を行った例で、評価時期はこれらの結果が総合して得られる4週としたものです。
腸内フローラ解析の結果のみをもって効果の解釈をすることは非常に難しく、他の評価系と合わせて評価するに当たって、最適な摂取期間の設定してください。
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  主な試験例 (1)脂肪蓄積抑制・肥満予防
    (2)脂肪分解・脂肪燃焼
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