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老化/糖化研究関連キットシリーズ 【Aging/Glycation Assay Kit Series】
糖類は、生命活動において不可欠な栄養素であるが、一方で生体内のタンパク質のリジンやアルギニン残基を修飾しタンパク質の荷電を変化させて立体構造が変化し、酵素の活性や構造タンパク質の立体構造に大きく影響を及ぼすことが知られています。この反応はメイラード反応(Glycation)もしくは糖化と呼ばれ、アマドリ転位物が生成する前期反応と、酸化、脱水、縮合などの反応を経て後期生成物(Advanced Glycation End-products:AGEs)に至る後期反応に分けられます。皮膚、血管壁、骨などあらゆる臓器を形成する構造タンパク質であるコラーゲンも例外ではなく糖化反応を受けます。
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糖化反応の経路
生体内糖化反応は多経路・多段階で起きる
  近年、AGEsは生体内においてグルコースだけではなく、グルコースの代謝中間体や分解物、メイラード反応中間体などからも生成することが報告され、 生体内で生成されるAGEsの中でも、特に糖代謝中間体に由来するグリセルアルデヒド由来のAGEsが疾患の発症や進展に強く関わっていることが報告されています。
  コラーゲン抗糖化アッセイキット(AK70,AK71)は96-well plateを用いることにより、無細胞および無酵素的にコラーゲンの糖化反応を追うことができるキットです。 コラーゲンの糖化反応を阻害する物質のスクリーニングを容易に行うことができます。 機能性食品および化粧品開発における抗糖化素材開発にご利用ください。
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糖化反応の経路
特異的AGEsであるCML, CMAの生成経路
  カルボキシメチルリジン:Nε-(carboxymethyl) lysine: CMLは非蛍光性・非架橋性AGEsの一種で、糖化修飾されたタンパク質のリジン残基 (フルクトースリジン)が遷移金属から生成するヒドロキシラジカル、一酸化窒素由来のペルオキシナイトライト、炎症反応によって生成する次亜塩素酸により酸化されて生成する糖酸化生成物で、生体における主要 な抗原性のAGEs構造として報告されています。また、CMLはグルコースの酸化分解より生成するグリオキサールを介して生成する経路も知られています。CMLは加齢に伴う皮膚コラーゲンへの蓄積など、長期的な酸化 ストレス蓄積の指標となるほか、アテローム性動脈硬化、糖尿病、アルツハイマー等との関連性も指摘されています。
  カルボキシメチルアルギニン:Nω-(carboxymethyl) arginine: CMAは、AGEsの一種でグリオキサールとアルギニンが反応して生成されます。 また、CMAは非蛍光性・非架橋性AGEsという特徴があり、コラーゲンに特異的に生成することが報告されています。生体コラーゲンにAGEsが蓄積すると、コラーゲンの変性に伴って線維芽細胞にも 悪影響を及ぼし、血管のみならず肌の老化の要因になると言われています。
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糖代謝とRAGE反応性AGEsの生成経路
糖代謝とRAGE反応性AGEsの生成経路
  Receptor for AGEs(RAGE)は、単球やマクロファージの他に神経や腎臓、血管平滑筋細胞等での発現が見られるAGEs受容体の一種です。 RAGEはAGEsと結合すると炎症や酸化ストレスに対して亢進的に作用することは示唆されており、特に生体内でのAGEs産生に関与する加齢性疾患のバイオマーカーとして注目されてきました。またRAGEはAGEsの中でも、疾患に強く関与するとされるグリセルアルデヒド由来AGEsに高い選択性をもって結合し、特に近年アルツハイマーに代表される神経変性疾患への関与も報告されています。 したがってRAGEとグリセルアルデヒド由来AGEsとの相互作用を検証ことは、糖化反応を介した疾患発症の病態解明において有用かつ新規の知見を与えうることを示しています。 近年では、RAGEが癌細胞表面にある特定フォームのコンドロイチン硫酸やへパラン硫酸といった硫酸化グリコサミノグリカンと結合し、癌移転のメカニズムに関与すうとの報告もあり、その研究需要の範囲は拡大の傾向にあります。
RAGE結合性AGEsの検出方法
RAGE結合性AGEsの検出方法
  96 well Plateに固相化されたアルブミンをグリセルアルデヒドで糖化反応させたときに生じるAGEs(Glyceraldehyde-AGEs)をリコビナントRAGE-Fcを用いて検出しました。
老化/糖化研究関連キットシリーズ <特徴と用途>
品番 品名 特徴 用途
AK70 コラーゲン抗糖化アッセイキット
グルコース/フルクトース
コラーゲンゲルにグルコースもしくはフルクトースを添加した時に起こる糖化反応を蛍光でモニタリングする。アッセイ期間は10日〜4週間。 抗糖化物質の
スクリーニング
AK71 コラーゲン抗糖化アッセイキット
グリセルアルデヒド
コラーゲンゲルにグリセルアルデヒドを添加した時に起こる糖化反応を蛍光でモニタリングする。アッセイ期間は2日。
AK72 軟骨U型コラーゲン抗糖化アッセイキット
グリセルアルデヒド
軟骨U型コラーゲンゲルにグリセルアルデヒドを添加した時に起こる糖化反応を蛍光でモニタリングする。
AAS-AGE-K01 アルブミン抗糖化アッセイキット
グリセルアルデヒド
BSA(アルブミン)溶液にグリセルアルデヒドを添加した時に起こる糖化反応を蛍光でモニタリングする。アッセイ期間は1日。
AAS-AGE-K05 エラスチン抗糖化アッセイキット
グリセルアルデヒド
エラスチン溶液にグリセルアルデヒドを添加した時に起こる糖化反応を蛍光でモニタリングする。アッセイ期間は3〜6日。
AAS-AGE-K02 コラーゲンAGEs抗糖化アッセイキット
CML特異的, グリオキサール
96well Plateに固相化されたコラーゲンにグリオキサールを添加した時に起こる糖化反応をCML特異的抗体で検出(ELISA法) CML生成阻害物質の
スクリーニング
AAS-AGE-K03 コラーゲンAGEs抗糖化アッセイキット
CMA特異的, グリオキサール
96well Plateに固相化されたコラーゲンにグリオキサールを添加した時に起こる糖化反応をCMA特異的抗体で検出(ELISA法) CMA生成阻害物質の
スクリーニング
AAS-AGE-K04 RAGE反応性AGEs生成阻害アッセイキット 96well Plateに固相化されたアルブミンをグリセルアルデヒドで糖化反応させたときに生じるAGEs(Glyceraldehyde-AGEs)をリコンビナントRAGE-Fcを用いて検出 Glyceraldehyde-AGEs形成阻害物質のスクリーニング
 
コード 品名 容量 価格
AK70
リニューアル
コラーゲン抗糖化アッセイキット
(グルコース/フルクトース)
中和コラーゲン溶液 10 mL \33,000
グルコース溶液 (200 mM) 10 mL
フルクトース溶液 (200 mM) 10 mL
アミノグアニジン溶液 (20 mM) 0.5 mL
緩衝液 30 mL
AK71
リニューアル
コラーゲン抗糖化アッセイキット
(グリセルアルデヒド)
中和コラーゲン溶液 10 mL
\48,000
グリセルアルデヒド溶液(500 mM) 2 mL
アミノグアニジン溶液 (20 mM) 0.5 mL
緩衝液 30 mL
AK72

軟骨U型コラーゲン抗糖化アッセイキット
(グリセルアルデヒド)
軟骨U型コラーゲン酸性溶液 5 mL
\48,000
中和液 5 mL
グリセルアルデヒド溶液(500 mM) 2 mL
アミノグアニジン溶液 (20 mM) 0.5 mL
緩衝液 30 mL
AAS-AGE-K01 アルブミン抗糖化アッセイキット
(グリセルアルデヒド)
牛血清アルブミン(BSA)溶液 10 mL \48,000
グリセルアルデヒド溶液(500 mM) 2 mL
緩衝液 30 mL
アミノグアニジン溶液 (20 mM)
※抗糖化標準物質
0.5 mL
AAS-AGE-K02 コラーゲンAGEs抗糖化
アッセイキット
(CML特異的, グリオキサール)
コラーゲン固相化 96ウェルプレート
アルミパウチ入り(8-well×12 strips)
1 枚
\80,000
プレートシール 2 枚
アミノグアニジン溶液(10 mM)
※抗糖化標準物質
250 μL
検体希釈液 30 mL
グリオキサール溶液(20 mM) 5 mL
洗浄バッファー(×10) 50 mL
ブロッキングバッファー 50 mL
抗CML抗体(×100) 100 μL
HRP標識二次抗体(×100) 100 μL
発色液 10 mL
停止液 10 mL
AAS-AGE-K03 コラーゲンAGEs抗糖化
アッセイキット
(CMA特異的, グリオキサール)
コラーゲン固相化 96ウェルプレート
アルミパウチ入り(8-well×12 strips)
1 枚 \80,000
プレートシール 2 枚
アミノグアニジン溶液(10 mM)
※抗糖化標準物質
250 μL
検体希釈液 30 mL
グリオキサール溶液(4 mM) 5 mL
洗浄バッファー(×10) 50 mL
ブロッキングバッファー 50 mL
抗CMA抗体(×100) 100 μL
HRP標識二次抗体(×100) 100 μL
発色液 10 mL
停止液 10 mL
AAS-AGE-K04 RAGE反応性AGEs生成阻害
アッセイキット
アルブミン固相化 96ウェルプレート
アルミパウチ入り(8-well×12 strips)
1 枚 \125,000
プレートシール 2 枚
検体希釈液 30 mL
グリセルアルデヒド溶液(100 mM) 5 mL
アミノグアニジン溶液(20 mM)
※抗糖化標準物質
500 μL
洗浄バッファー(×10) 30 mL
ブロッキングバッファー 10 mL
RAGE-Fc溶液 5 mL
ALP標識プロテイン A/G 5 mL
発色液用タブレット(5 mL用) 3 個
発色液調製用緩衝液 15 mL
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製品特性/用途
 AK70/71
糖化コラーゲンから出る蛍光性AGEs(励起波長370 nm、蛍光波長440 nm)を指標にした測定で抗糖化作用成分の探索に適している。
 AAS-AGE-K02/03
コラーゲンから生成したCMA/CMLを指標に、糖化反応を阻害する物質のスクリーニングを簡便に行うことが可能。 機能性食品および化粧品開発における抗糖化素材開発に有用。
 AAS-AGE-K04
リコンビナントRAGE-Fcを用いてGlyceraldehyde-AGEs形成を阻害する物質のスクリーニングを簡便に行うことが可能。 機能性食品および化粧品開発における抗糖化素材開発に有用。
 
実施例
糖化コラーゲン生成率 【実施例1】 コラーゲン抗糖化アッセイキット(AK70)

コラーゲン・ゲルをフルクトースで糖化反応させ、糖化コラーゲン生成率を測定しました。
その結果、アミノグアニジン溶液(糖化反応阻害剤)と同様にドクダミ抽出物、アスパラガス擬葉抽出物は、コラーゲンの糖化を濃度依存的に抑制しました。
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CML 【実施例2】 コラーゲンAGEs抗糖化アッセイキット〈CML特異的, グリオキサール〉(AAS-AGE-K02)

グリオキサールで1日間糖化させた糖化コラーゲンから生成するCMLを用いた抗糖化素材の探索。濃度はウェル中の終濃度を示す。
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測定結果 【実施例3】 コラーゲンAGEs抗糖化アッセイキット〈CMA特異的, グリオキサール〉(AAS-AGE-K03)

グリオキサールで7日間糖化させた糖化コラーゲンから生成するCMAを用いた抗糖化素材の探索。濃度はウェル中の終濃度を示す。
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測定結果 【実施例4】 RAGE反応性AGEs生成阻害アッセイキット(AAS-AGE-K04)

陽性コントロールとしてアミノグアニジン溶液、試験試料として各種アミノ酸(リジン、アルギニン)および没食子酸のRAGE反応性AGEs生成阻害を検討した。
その結果、アミノ酸はいずれも濃度依存的に抗糖化活性を有することが認められた。
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